国开题库《植物病虫害防治基础》实验任务1-国开题库网

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实验报告

实验名称植物病害生防菌的分离、培养

实验目的

生防菌主要包括细菌、放线菌和真菌三大类，其分离与培养是利用生防菌进行植物病害生物防治研究和应用的基础前提。为获得生防菌的纯培养物，需先将目的生防菌从基质中分离出来，再根据不同生防微生物的营养需求和环境适应特点，使其在平板培养基上形成单菌落，进而获得纯培养物。

通过本实验，学习生防菌的常规分离、培养和纯化技术，掌握从菌落形态、培养特征等方面区分细菌、放线菌和真菌的方法，为后续植物病害生物防治相关研究奠定技术基础。

实验步骤

（一）土壤生防菌的分离和培养

1. 土壤生防菌的分离

土壤稀释平板法是分离和计数土壤中放线菌、细菌及大量产孢真菌的常用方法，具体操作如下：

① 取经过风干、过筛处理后的土样 10 g，放入盛有 90 mL 无菌水的三角瓶中，振荡约 20 min，使土壤与水充分混合，分散其中的微生物，制成 10⁻¹ 浓度土壤悬浮液；

② 在悬浮液沉降前，吸取 1 mL 注入另一盛有 9 mL 无菌水的三角瓶中，振荡摇匀，制成 10⁻² 浓度悬浮液；按同样方法逐级稀释，制备不同梯度的系列悬浮液；

③ 根据土样特性及目标分离微生物类型，取适宜稀释度的悬浮液 0.1 mL，滴加在已制备好的平板培养基上，用无菌玻璃刮铲将稀释液在培养基表面充分混匀铺平，随后倒置于 25~30℃恒温箱中培养；

④ 依据不同微生物的生长速度差异，分别在培养 2d、3d、5d 时观察并记载分离结果。通常，适宜分离稀释度为：放线菌 10⁻³~10⁻⁴、细菌 10⁻⁵~10⁻⁶、真菌 10⁻⁴~10⁻⁵，此稀释度下每个平板可形成 50~150 个菌落，便于计数和纯化。

注：分离一般真菌和细菌常用 PDA 培养基和牛肉膏蛋白胨琼脂（NA）培养基；为提高分离效果，可在 PDA 培养基中加入 1000 mg/kg 链霉素抑制细菌生长，或在 NA 培养基中加入五氯硝基苯抑制真菌生长；放线菌分离通常采用高氏 1 号培养基。

2. 土壤中生防菌的培养

分离于平板的生防细菌和放线菌，置于 28℃恒温培养（真菌培养温度为 25℃左右），待菌落长出后，用无菌接种环挑取单菌落进行平板划线培养；再次形成单菌落后，转接至斜面培养基划线培养，最后置于 4℃冰箱中保存。真菌则用无菌接种铲取菌落边缘（连同少量培养基）转入斜面培养基，待产孢后置于 4℃冰箱保存。

（二）植物体表生防菌的分离和培养

1. 生防菌的分离

（1）水洗法

① 取植物叶片 5～10 张，在自来水下冲洗去除表面浮土，晾干后用无菌打孔器打取直径 1 cm 的圆片；

② 称取 0.5 g 叶片圆片样品，置于盛有 100 mL 无菌水的三角瓶内，振荡 20～30 min，获得植物样品水洗液；

③ 吸取 0.1 mL 水洗液，滴加在培养基平板表面并涂匀，置于 25~30℃恒温箱培养，2~5d 后取出观察菌落生长情况并计数。

（2）悬浮液稀释平板法

① 取植物叶片 5～10 张，自来水冲洗去除浮土，晾干备用；

② 称取 1g 叶片样品，在无菌研钵中研碎后，放入盛有 100 mL 灭菌水的三角瓶中，用磁力搅拌器振荡约 20 min，制成 10⁻² 浓度植物体表悬浮液；

③ 在悬浮液沉降前，吸取 1 mL 注入另一盛有 9 mL 无菌水的三角瓶中，振荡摇匀，按此方法逐级稀释，制备不同梯度的系列悬浮液；

④ 根据目标微生物类型，取适宜稀释度的悬浮液 0.1 mL，滴加在平板培养基上，用玻璃刮铲混匀铺平，倒置于 25~30℃恒温箱培养；

⑤ 分别在培养 2d、3d、5d 时检查菌落生长情况并计数。

2. 生防菌的培养

生防菌的培养基选择、培养条件、纯化步骤及菌种保存方法，参照前述 “土壤生防菌的培养” 相关操作执行。

（三）植物体内生防菌的分离和培养

1. 生防菌的分离

（1）植物内生真菌的分离

① 取植物叶片 5～10 张，用自来水冲洗干净，去除表面浮土及附着生物；

② 剪取 0.5 cm² 的组织小块，先在 75% 乙醇中浸泡 30～60 s，立即转入 3% 次氯酸钠消毒液中浸泡 5 min，随后用无菌水冲洗 3 次，置于无菌滤纸上吸干表面水分，接种至 PDA 培养基平板上，放入 25℃恒温培养箱培养。

（2）植物内生细菌的分离

① 取健康无病植株的根、茎、叶等组织，分别用自来水冲洗干净；随机称取 0.5 g 组织样品，在 75% 酒精中振荡浸泡 30~60 s，再用 2% 次氯酸钠溶液振荡浸泡（叶片 1 min、茎 3 min、根 5 min），之后用无菌水冲洗 4 次；以最后一次清洗的无菌水涂板作为对照，检验表面消毒是否彻底（若对照平板无菌落生长，说明消毒合格）；

② 在无菌条件下，将消毒后的组织研磨成匀浆，进行梯度稀释后涂平板，置于 28℃黑暗环境中培养 48 h。

2. 生防菌的培养

生防菌的培养基选择、培养条件、纯化步骤及菌种保存方法，参照前述 “土壤生防菌的培养” 相关操作执行。

实验结果

从植物病害防治角度而言，生物防治是指利用生物及其代谢产物防治植物病害、控制病原体的方法，其实质是利用生物种间关系与种内关系，调节有害生物种群密度，即通过生物类群防治另一生物类群。我国植物病理学家陈延熙结合多年实践及国际生物防治发展方向，提出了更贴合自然规律的生防概念：植物病害的生物防治是在农业生态系统中，调节寄主植物的微生物环境，使其利于寄主生长而不利于病原物繁殖，或对寄主与病原物的相互作用产生有利寄主、不利病原物的影响，最终达到防治病害的目的。

本次实验通过土壤稀释平板法、植物体表水洗法、悬浮液稀释平板法及植物体内组织分离法，成功从土壤、植物体表及植物体内分离出多种微生物菌落。根据菌落形态、颜色、边缘特征及培养周期等，初步鉴别出细菌、放线菌和真菌三类微生物：细菌菌落通常较小、表面光滑或粗糙、边缘整齐，培养 2~3d 即可形成；放线菌菌落呈绒毛状或粉状、颜色多样（白、粉、黄等），培养 3~5d 形成，质地较致密；真菌菌落较大、呈絮状或绒毛状、颜色丰富（白、绿、黑等），培养 2~5d 形成，易扩散。

讨论或结论

用于植物病害防治的生防微生物主要包括细菌、真菌和放线菌，其控制植物病害的核心机制可归纳为以下 6 类：